wotson

  • Dokumenty43 372
  • Odsłony2 001 032
  • Obserwuję1 363
  • Rozmiar dokumentów64.9 GB
  • Ilość pobrań1 438 138

Svante Pääbo - Neandertalczyk. W poszukiwaniu zaginionych genomów

Dodano: 3 lata temu
R E K L A M A

Informacje o dokumencie

Dodano: 3 lata temu
Rozmiar :2.8 MB
Rozszerzenie:pdf

Moje dokumenty

wotson
EBooki - alfabetycznie, wg imion
S

Svante Pääbo - Neandertalczyk. W poszukiwaniu zaginionych genomów.pdf

wotson EBooki - alfabetycznie, wg imion S
Użytkownik wotson wgrał ten materiał 3 lata temu. Od tego czasu zobaczyło go już 17 osób, 26 z nich pobrało dokument.

Komentarze i opinie (0)

Transkrypt ( 25 z dostępnych 251 stron)

Tytuł oryginału NEANDERTHAL MAN IN SEARCH OF LOST GENOMES Copyright © 2014 by Svante Pääbo All rights reserved Projekt okładki Prószyński Media Grafika komputerowa na okładce © Indigo Images Redaktor serii Adrian Markowski Redakcja Aneta Kanabrodzka Korekta Grażyna Nawrocka ISBN 978-83-8069-778-2 Warszawa 2015 Wydawca Prószyński Media Sp. z o.o. 02-697 Warszawa, ul. Rzymowskiego 28 www.proszynski.pl

Lindzie, Rune i Frei

Przedmowa Pomysł, by napisać tę książkę, podsunął mi John Brockman. Bez jego zachęty i wsparcia nigdy nie porwałbym się na przygotowanie czegoś dłuższego niż przeciętny artykuł naukowy. Muszę jednak przyznać, że już po rozpoczęciu pracy poczułem, iż sprawia mi ona przyjemność. John, to dzięki Tobie! Chcę też podziękować wszystkim, którzy zadali sobie trud przeczytania brudnopisu i pomogli mi swoimi uwagami w opracowaniu ostatecznej wersji tej opowieści. W pierwszej kolejności pragnę wyrazić wdzięczność mojej żonie, Lindzie Vigilant, za jej nieustające wsparcie, chociaż pracując nad książką, miałem mniej czasu dla rodziny. Szczerze doceniam pomoc znakomitych redaktorów i pracowników wydawnictwa Basic Books, między innymi Sarah Lippincot, Carol Rowney, Christine Arden, a przede wszystkim – Toma Kellehera. Mam nadzieję, że dzięki nim sporo się nauczyłem. Jestem też wdzięczny Carlowi Hannestadowi, Kerstin Lexander i Violi Mittag za ich cenne sugestie. Osobne podziękowania kieruję do Soukena Danjo, który pomógł mi się na trochę odizolować od współczesnego świata i złapać chwilę oddechu w Saikouji. Wszystkie wydarzenia w książce przedstawiam tak, jak je zapamiętałem, nie mam jednak wątpliwości, że coś tu i ówdzie mogłem przekręcić albo dwie sprawy połączyć w jedną, zwłaszcza gdy dotyczyło to spotkań i rozmów, między innymi wizyty w Berlinie czy siedzibie 454 Life Sciences. Siłą rzeczy niektóre zdarzenia opisuję subiektywnie, choć zawsze starałem się też pokazać opinię drugiej strony, bo mam pełną świadomość, że na pewne sprawy można spojrzeć z perspektywy innej niż moja. Na koniec pragnę przeprosić wszystkich, o których nie wspomniałem w tekście, choć na to zasługują, zależało mi jednak, by lektury nie zakłócało zbyt wiele nazwisk i odniesień.

Rozdział 1 Neandertalczyk ex machina Było to w roku 1996. Telefon zadzwonił późnym wieczorem, gdy już zasypiałem. W słuchawce usłyszałem Matthiasa Kringsa, doktoranta z mojego laboratorium w Instytucie Zoologicznym uniwersytetu monachijskiego. Powiedział tylko trzy słowa: „To nie człowiek”. „Zaraz będę”, wymamrotałem. Narzuciłem coś na siebie i pojechałem na drugi koniec miasta. Wcześniej tego samego dnia Matthias uruchomił sekwenatory DNA i rozpoczął odczytywanie materiału genetycznego, który wcześniej wyizolował (a później namnożył) z kawałka kości ręki neandertalczyka, otrzymanej z Muzeum Regionu Nadreńskiego w Bonn. Lata doświadczeń nauczyły mnie tonować oczekiwania – mogło to być DNA bakteryjne lub ludzkie, które zanieczyściło wiekową kość; przez blisko 140 lat od jej wykopania było po temu wiele okazji. W głosie Matthiasa wyraźnie jednak pobrzmiewało podniecenie. Czyżby naprawdę udało mu się pozyskać materiał genetyczny wymarłego 30 tys. lat temu neandertalczyka, bliskiego krewnego – a może nawet przodka – człowieka współczesnego? Wydawało się to raczej mało prawdopodobne. W laboratorium zastałem Matthiasa i Ralfa Schmitza, młodego archeologa, który pomógł nam uzyskać pozwolenie na wycięcie kawałka kości ręki ze sfosylizowanych szczątków neandertalczyka przechowywanych w bońskim muzeum. Obaj z trudem powściągali radość, pokazując mi odczytane przez sekwenator kombinacje liter „A”, „C”, „G” i „T”. Sekwencja nie przypominała żadnej z dotychczas nam znanych. To, co dla niewprawnego oka wydaje się zupełnie przypadkowym ciągiem czterech nieregularnie powtarzających się liter, jest w istocie skróconym zapisem chemicznej struktury DNA, materiału genetycznego obecnego niemal w każdej komórce naszego ciała. Nici podwójnej helisy składają się z cegiełek nazywanych nukleotydami: adeniny (A), tyminy (T), guaniny (G) i cytozyny (C). W kolejności ich występowania w łańcuchu, czyli sekwencji, jest zakodowana informacja genetyczna niezbędna do rozwoju i funkcjonowania każdego żywego organizmu. Fragment DNA, który tak nas zainteresował, pochodził z DNA mitochondrialnego (w skrócie mtDNA), które matka

przekazuje swoim dzieciom wraz z mitochondriami komórki jajowej, a to znaczy, że jest ono dziedziczone tylko w linii żeńskiej. Niektóre rodzaje komórek zawierają nawet kilkaset takich cząsteczek. Na ich matrycy powstają białka zaangażowane w produkcję energii, co jest podstawową funkcją mitochondriów. Mitochondrialne DNA stanowi zaledwie 0,0005 procent całego naszego genomu, ale ponieważ występuje w wielu kopiach, jego pozyskiwanie i analizy są stosunkowo proste. Oczywiście większa jest też szansa, że w kościach sprzed tysięcy lat przetrwa właśnie mtDNA, a nie pozostała, chromosomalna część genomu przechowywana w jądrze komórkowym zaledwie w dwóch kopiach (od matki i ojca). Do 1996 roku odczytano tysiące sekwencji mtDNA pochodzącego od ludzi z różnych stron świata. Zwykle wszystkie nowo odczytane odcinki porównuje się z sekwencją referencyjną, pierwszą, którą udało się poznać, będącą stałym punktem odniesienia. Porównania te pozwalają określić, jakie różnice i w których miejscach ciągu liter występują najczęściej. Co niezwykłe, w odczytanej właśnie sekwencji mtDNA z kości neandertalczyka występowały różnice niepodobne do żadnych z tysięcy dotychczas poznanych w obrębie ludzkiej populacji. Trudno było w to uwierzyć. Niemal natychmiast – zresztą jak zawsze, kiedy mam do czynienia z wyjątkowo ekscytującym lub niespodziewanym wynikiem doświadczenia – opadły mnie wątpliwości. Zacząłem szukać dziury w całym; zastanawiać się, gdzie mogliśmy popełnić błąd. A jeśli ktoś w muzeum użył podczas prac konserwacyjnych kleju na bazie żelatyny? Czy w takim wypadku wykrylibyśmy bydlęce mtDNA? Natychmiast to sprawdziliśmy, bo na szczęście ktoś już je kiedyś zsekwencjonował, ale wynik badania wykluczył taką możliwość. Nowa sekwencja była zdecydowanie podobniejsza do ludzkiej, niemniej wciąż znacząco od niej odbiegała. Wyglądało na to, że pochodzi od człowieka, lecz innego od wszystkich ludzi żyjących dziś na Ziemi. Powoli do mnie docierało, że mamy przed sobą pierwszy odczytany fragment DNA wymarłego gatunku. Otworzyliśmy szampana, od dawna przechowywanego w lodówce w pokoju socjalnym na specjalną okazję. Świetnie zdawaliśmy sobie sprawę, że jeśli naprawdę zsekwencjonowaliśmy DNA neandertalczyka, to stoimy u progu wielkiej naukowej przygody. Czy to możliwe, że pewnego dnia będziemy porównywać geny między przedstawicielami tego gatunku a ludźmi współczesnymi? Wieczorem nieco przesadziłem z szampanem, więc wracałem ulicami uśpionego Monachium na piechotę. Wciąż trudno mi było uwierzyć w to, co się wydarzyło. Długo nie mogłem zasnąć; myślałem o neandertalczykach i o tym wyjątkowym osobniku, którego mtDNA trafiło w nasze ręce. W 1856 roku, na trzy lata przed ukazaniem się O powstawaniu gatunków Karola Darwina, robotnicy pracujący w niewielkiej jaskini w kamieniołomie niedaleko Doliny Neandra, 11 km na wschód od Düsseldorfu, natknęli się na górną część czaszki i kilka

kości należących, jak im się wydawało, do niedźwiedzia. Po kilku latach okazało się jednak, że są to szczątki wymarłego gatunku człowieka, być może nawet naszego bezpośredniego przodka. Znalezisko – wówczas pierwsze tego rodzaju – wstrząsnęło światem przyrodników. Wszyscy chcieli się dowiedzieć, kim byli neandertalczycy, dlaczego wyginęli około 30 tys. lat temu, a także jak układały się ich stosunki z naszymi przodkami, skoro jedni i drudzy żyli obok siebie w Europie przez tysiące lat (ilustracja 1.1). Podczas badań odkryto między innymi intrygujące podobieństwa między zachowaniami naszymi i neandertalczyków, którzy opiekowali się rannymi, urządzali rytualne pogrzeby, a może nawet tworzyli muzykę. Pod wieloma względami przypominali nas dużo bardziej niż małpy. Jak bliskie było to podobieństwo? Czy neandertalczycy potrafili mówić? Czy stanowili ślepą odnogę ewolucyjnego drzewa homininów, czy też może niektóre ich geny przetrwały w naszym genomie? Wszystkie te zagadnienia znalazły się w obszarze badań paleoantropologii, dyscypliny, która narodziła się w chwili odkrycia pierwszych kości w Dolinie Neandra. Tych samych, z których właśnie pozyskaliśmy informację genetyczną i ją odczytaliśmy.

Ilustracja 1.1. Zrekonstruowane szkielety neandertalczyka (po lewej) i człowieka współczesnego (po prawej). Prawa autorskie: Ken Mowbray, Blaine Maley, Ian Tattersall, Gary Sawyer, Amerykańskie Muzeum Historii Naturalnej. Poszukiwanie odpowiedzi na powyższe pytania było fascynujące, ale badania fragmentu kości neandertalczyka mogły nam pomóc wyjaśnić jeszcze ciekawszą zagadkę. Neandertalczycy to najbliżsi krewni człowieka współczesnego, zatem było niemal pewne, że ich geny okażą się podobne do naszych. Kilka lat wcześniej mój zespół zsekwencjonował sporą liczbę fragmentów genomu szympansa i okazało się, że różnice między odpowiadającymi sobie sekwencjami w obu genomach – szympansim i ludzkim – dotyczą zaledwie ponad procentu nukleotydów. Różnica między nami

a neandertalczykami była zapewne jeszcze mniejsza, ale to jednak właśnie w jej obrębie skrywały się zmiany decydujące o oddzieleniu się naszej linii ewolucyjnej od linii naszych krewnych. Nie tylko od neandertalczyków, lecz także od przedstawicieli grup, do których należeli chłopiec z Turkany (1,6 mln lat temu), Lucy (3,2 mln lat temu) czy człowiek pekiński (0,5 mln lat temu). To właśnie dzięki tej niewielkiej genetycznej odmienności zaczęliśmy się porozumiewać za pomocą mowy, stworzyliśmy kulturę i technikę, potrafimy tworzyć i doceniać sztukę. Badanie neandertalskiego DNA mogło pomóc w ustaleniu, co właściwie uczyniło nas ludźmi. Świtało już, gdy pogrążony w słodkich marzeniach, może nawet ocierających się o megalomanię, zapadłem w sen. Nazajutrz pojawiłem się w laboratorium późno, podobnie jak Matthias. Po kolejnym przejrzeniu sekwencji i upewnieniu się, że jednak nie zaszła żadna pomyłka, zaczęliśmy się zastanawiać, co dalej. Odczytanie krótkiego kawałka mtDNA ze szczątków neandertalczyka to jedno, a przekonanie samych siebie, nie mówiąc o reszcie świata, że to mtDNA naprawdę pochodziło od osobnika, który żył – w tym konkretnym przypadku – blisko 40 tys. lat temu, to drugie. Dzięki doświadczeniu, którego nabyłem przez ostatnich 12 lat, wiedziałem, co należy teraz zrobić. Po pierwsze, konieczne było powtórzenie eksperymentu – nie jego ostatniej fazy, lecz całego doświadczenia, począwszy od zdobycia nowego kawałka kości. Było to niezbędne, by wykazać, że otrzymana przez nas sekwencja nie pochodziła na przykład z uszkodzonego i chemicznie zmienionego współczesnego mtDNA, które zanieczyściło próbkę. Po drugie, powinniśmy odczytać dłuższy odcinek sekwencji, a najlepiej zidentyfikować fragmenty nachodzące na ten już odczytany. Wydłużenie odczytanego odcinka pozwoliłoby dokładniej ustalić, na ile sekwencja neandertalskiego mtDNA różni się od ludzkiej. No i było jeszcze „po trzecie”. Zawsze zgadzałem się ze zdaniem, że nadzwyczajne twierdzenia wymagają nadzwyczajnych dowodów. W przypadku badań nad DNA pochodzącym z bardzo starych kości za taki właśnie nadzwyczajny dowód uważałem przeprowadzenie eksperymentu i potwierdzenie wyników w innym laboratorium – choć w dość konkurencyjnym świecie naukowym na ogół się tego nie praktykuje. Byłem przekonany, że tylko uzyskanie takich samych rezultatów przez niezależną od nas grupę badawczą da nam pewność, że nie doszło do zanieczyszczenia ani do żadnego błędu w metodyce. Jednocześnie zgadzałem się z Ralfem i Matthiasem, że dopóki nie będziemy w pełni przekonani, że nasze wyniki są prawidłowe, dopóty należy zachować absolutną dyskrecję. Matthias z nową energią zabrał się do pracy, co mnie specjalnie nie dziwiło, ponieważ trzy poprzednie lata spędził na bezowocnych w dużej mierze próbach pozyskania DNA z egipskich mumii. Ralf natomiast niezbyt cieszył się z powrotu do Bonn, gdzie mógł tylko czekać z założonymi rękami na wiadomość od nas. Ja sam próbowałem zająć się inną pracą, ale trudno było mi się skupić, gdy mój kolega

zajmował się potwierdzaniem otrzymanych poprzedniej nocy wyników. Wbrew pozorom było to dość skomplikowane. W końcu nie mieliśmy do czynienia ze świeżym i nieuszkodzonym DNA pozyskanym z próbki krwi honorowego krwiodawcy. Elegancka, uporządkowana helikalna cząsteczka DNA, taka, jak się ją przedstawia w podręcznikach, czyli składająca się z dwóch podążających naprzeciw siebie łańcuchów zbudowanych z reszt cukrowych i fosforanowych, zespolonych komplementarnymi parami nukleotydów (adeniny z tyminą, guaniny z cytozyną) jest bardziej wyobrażeniem niż odzwierciedleniem rzeczywistości. Tak naprawdę obecne w jądrze komórkowym i mitochondriach DNA nie jest statyczną konstrukcją, lecz związkiem chemicznym stale wchodzącym w interakcje z otoczeniem. Cały czas pojawiają się w nim uszkodzenia, usuwane na bieżąco dzięki wyspecjalizowanej i złożonej komórkowej maszynerii. Na dodatek jest bardzo, ale to bardzo długie. Każdy z naszych 23 chromosomów to pojedyncza, gigantyczna cząsteczka DNA. Haploidalny genom człowieka składa się z 3,2 mld par nukleotydów, a ponieważ w jądrze komórkowym znajdują się dwie jego kopie, czyli 46 chromosomów (jeden z pary pochodzi od ojca, a drugi od matki), w istocie liczy sobie 6,4 mld par nukleotydów. W porównaniu z tymi olbrzymimi cząsteczkami mitochondrialne DNA jest maleńkie, zawiera zaledwie 16 500 par zasad. Wprawdzie występuje w wielu kopiach, ale to wyizolowane z kości z pewnością było mocno zanieczyszczone i pofragmentowane. Najczęstszym uszkodzeniem DNA, czy to mitochondrialnego, czy jądrowego, jest utrata grupy aminowej z cytozyny (C), zmieniająca ją w „nienaturalny” nukleotyd – uracyl (U). Oczywiście w komórce działają odpowiednie enzymatyczne systemy naprawcze usuwające uracyl i zastępujące go właściwym nukleotydem, cytozyną. Wycięte cząsteczki uracylu trafiają następnie do komórkowego śmietnika. Na podstawie badań uszkodzonych nukleotydów wydalanych z organizmu wraz z moczem naukowcy ustalili, że codziennie w każdej komórce ciała około 10 tys. razy cytozyna zmienia się w uracyl, co następnie jest korygowane. A to tylko jeden z przykładów chemicznych zagrożeń czyhających na nasz genom. Innym jest utrata nukleotydu. Powstająca wtedy szczerba mogłaby doprowadzić do przerwania helisy, ale zapobiegają temu enzymy, które uzupełniają podobne luki. Jeśli jednak mimo wszystko dojdzie do pęknięcia nici, inne wyspecjalizowane białka szybko połączą uszkodzone końce. Gdyby wszystkie te zabezpieczenia nie działały jak należy, cząsteczka DNA nie utrzymałaby się w komórce w jednym kawałku nawet przez godzinę. Rzecz jasna systemy naprawcze wymagają do działania energii. Gdy umieramy, przestajemy oddychać, a wtedy w komórkach kończy się tlen i wytwarzanie energii ustaje. Przestają wówczas działać procesy naprawcze DNA i natychmiast zaczynają się w nim gromadzić uszkodzenia, do czego dochodzą jeszcze procesy rozkładu. W żywej

komórce różne jej części są od siebie odizolowane. W niektórych przedziałach („kompartmentach”, jak mawiają biolodzy) znajdują się enzymy zdolne do przecinania nici DNA (zwykle potrzebne do jej naprawy), w innych są przechowywane enzymy rozkładające kwasy nukleinowe mikroorganizmów próbujących zainfekować komórkę. Po śmierci wszystkie bariery między komórkowymi kompartmentami rozpadają się, a uwolnione enzymy zaczynają rozkładać DNA. W ciągu godzin i dni nici DNA są cięte na coraz krótsze i krótsze kawałeczki, a przy tym akumulują liczne uszkodzenia chemiczne. W tym samym czasie bakterie bytujące w jelitach i płucach, niepowstrzymywane dotychczasowymi ograniczeniami, zaczynają szybko się mnożyć. Wszystkie te procesy niszczą stopniowo informację genetyczną, która najpierw służyła do kierowania rozwojem, a potem funkcjonowaniem ciała. Kiedy wymienione wyżej destrukcyjne procesy się kończą, znikają ostatnie ślady naszej biologicznej unikatowości. W pewnym sensie dopiero wtedy dopełnia się fizyczna śmierć. Warto jednak pamiętać, że każda z bilionów ludzkich komórek zawiera komplet informacji genetycznej, zatem jeżeli w jakiejś części rozkładającego się ciała nie dojdzie do pełnej degradacji komórek i DNA, wówczas przetrwa przynajmniej fragment genetycznego dziedzictwa. Weźmy na przykład enzymatyczne procesy rozkładu DNA – większość z nich przebiega tylko w obecności wody. Jeśli jakaś część ciała wyschnie wystarczająco szybko, to fragmenty DNA mogą przetrwać całkiem długo. Tak dzieje się na przykład podczas mumifikacji, bez względu na to, czy dochodzi do niej naturalnie, czy też ciało jest konserwowane w ten sposób intencjonalnie. Jak wiadomo, tego rodzaju zabiegi przeprowadzano w starożytnym Egipcie z powodów religijnych, w celu stworzenia schronienia dla duszy. W okresie 5–1,5 tys. lat temu praktyce tej poddano ciała setek tysięcy zmarłych. Niektóre części ciała, na przykład kości i zęby, nawet bez mumifikacji mogą przetrwać całkiem długo. W tych twardych tkankach znajdują się zagnieżdżone w mikroskopijnie małych jamkach komórki odpowiedzialne między innymi za formowanie się nowej kości, gdy dojdzie do pęknięcia lub złamania. Kiedy komórki te giną, ich DNA może się z nich wydostać, a następnie związać z niektórymi mineralnymi składnikami kości, co w niektórych przypadkach może uchronić kwas nukleinowy przed strawieniem przez enzymy. W ten sposób, przy dużej dozie szczęścia, DNA może przetrwać komórkowe procesy degradacyjne następujące bezpośrednio po śmierci. Czas jednak dalej robi swoje i rozkład, choć znacznie wolniej, wciąż postępuje, na przykład wskutek docierającego do Ziemi promieniowania kosmicznego, które powoduje powstawanie reaktywnych cząsteczek uszkadzających czy nawet rozrywających łańcuch DNA. Nie ustają także procesy chemiczne wymagające wody, jak choćby wspomniana deaminacja cytozyny do uracylu, nawet jeśli DNA znajduje się w relatywnie suchych warunkach. Ma ono duże powinowactwo chemiczne z wodą (jej

cząsteczki znajdują się w bruzdach helisy), a zatem niektóre reakcje zależne od wody wciąż zachodzą, choć powoli. Utrata grupy aminowej (deaminacja) cytozyny jest jednym z najszybszych tego typu procesów i do tego stopnia destabilizuje nici DNA, że w końcu pękają. Takie i podobne reakcje, z których wiele wciąż słabo poznano, z czasem „zjadają” DNA, któremu udało się przetrwać bezpośrednie katastrofalne następstwa śmierci komórki. Chociaż szybkość niszczenia DNA zależy od wielu czynników, między innymi od temperatury czy kwasowości środowiska, to nawet w warunkach sprzyjających konserwacji rozkład kiedyś dobiega końca. Znikają wtedy ostatnie strzępy informacji o danej osobie. W tym wypadku wyglądało jednak na to, że mimo upływu 40 tys. lat, w badanej przez nas kości neandertalczyka procesy rozkładu jeszcze się nie zakończyły. Matthias odczytał sekwencję mtDNA długości zaledwie 61 nukleotydów. Żeby to zrobić, musiał najpierw wielokrotnie powielić wyjściowy fragment DNA, co wymagało wykorzystania techniki łańcuchowej reakcji polimerazy, nazywanej PCR1. Powtarzając eksperyment, musiał zatem zacząć od ponownego przeprowadzenia PCR. Polegało to na wykorzystaniu dwóch krótkich, zsyntetyzowanych wcześniej fragmentów DNA nazywanych starterami (primerami), o sekwencji komplementarnej (umożliwiającej sparowanie się nukleotydów) do fragmentu matrycowego DNA z kości. Miejsca, do których miały się przyłączyć startery, dzieliło 61 nukleotydów. Matthias dodał startery do mieszaniny reakcyjnej, w której znajdowała się też maleńka ilość DNA pozyskanego z kości oraz enzym o nazwie polimeraza DNA, syntetyzujący nową nić, począwszy od przyłączonego startera. Taką mieszaninę podgrzewa się, wskutek czego obie nici tworzące helisę oddzielają się od siebie, po czym się ją ochładza. W tym czasie do rozdzielonych nici przyłączają się startery (na zasadzie komplementarności sekwencji A łączy się z T drugiej nici, a G z C). Ponownie zmienia się temperaturę, by była odpowiednia dla polimerazy DNA, która wydłuża drugą nić, zaczynając od początkowego, dwuniciowego już odcinka tworzonego przez starter przyłączony do nici matrycowego DNA. Następnie cały cykl się powtarza. Po pierwszym cyklu na matrycy dwóch rozdzielonych nici fragmentu DNA pozyskanej z kości powstają ich identyczne kopie, a więc nici są cztery, bo obie pochodzące z oryginalnej helisy zostają zduplikowane. W kolejnym cyklu jest ich już osiem, następnie 16, 32 i tak dalej – łącznie przez 40 cykli. Genialną w swojej prostocie technikę PCR opracował w 1983 roku naukowiec i ekscentryk Kary Mullis. Ma ona niezwykłą moc – po 40 cyklach na matrycy pojedynczego fragmentu DNA możemy uzyskać nawet bilion jego kopii! Tylko dzięki niej nasza praca ze starożytnym DNA2 była w ogóle możliwa. Kary Mullis naprawdę

zasłużył na Nagrodę Nobla z chemii, którą otrzymał w 1993 roku. Nadzwyczajna czułość PCR bywa też jednak problemem. W ekstrakcie z kości neandertalczyka w najlepszym wypadku mogły się znajdować tylko nieliczne fragmenty jego materiału genetycznego. Równocześnie istniało spore ryzyko zanieczyszczenia tego roztworu molekułami współczesnego pochodzenia. Śladowa ilość współczesnego ludzkiego DNA może się łatwo dostać do mieszaniny razem z reagentami, zanieczyszczeniami na powierzchni plastikowych probówek i naczyń, końcówek pipet automatycznych czy nawet z fruwającego w powietrzu kurzu. Kurz w pomieszczeniach, w których przebywają ludzie, to w dużej mierze fragmenty złuszczonego naskórka, z komórkami wciąż zawierającymi sporo DNA. Poza tym ludzkie DNA mogło zanieczyścić próbkę wcześniej – czy to w muzeum, czy nawet jeszcze podczas wykopalisk. Planując eksperyment, byliśmy świadomi wszystkich tych zagrożeń i dlatego właśnie wybraliśmy do sekwencjonowania przypuszczalnie najbardziej zmienny fragment neandertalskiego mtDNA. Wiedzieliśmy, że w tej części sekwencji występuje najwięcej różnic w obrębie współczesnej ludzkiej populacji, dlatego mieliśmy nadzieję, że uda nam się przynajmniej określić, czy badamy próbkę pochodzącą od jednej osoby, czy raczej jest ona zanieczyszczona DNA kilku osób. To właśnie dlatego tak nas ucieszyło odkrycie, że odczytany ciąg zawiera nieznane dotąd zmiany w niektórych nukleotydach. Gdyby bardziej przypominał zapis mtDNA współcześnie żyjących ludzi, nie moglibyśmy rozstrzygnąć, czy to dlatego, że mtDNA neandertalczyka niewiele się różniło od naszego, czy może wpatrujemy się w sekwencję człowieka współczesnego, gdyż jakiś fragment jego DNA dostał się do naszej mieszaniny, na przykład z cząstką kurzu z powietrza. Miałem wcześniej sporo okazji, by się przekonać, jak łatwo zanieczyścić próbki podczas eksperymentów. Przez 12 lat zajmowałem się głównie izolacją i badaniem starożytnego DNA mamutów, niedźwiedzi jaskiniowych czy leniwców naziemnych i wykrywałem ludzkie DNA niemal we wszystkich próbkach przygotowanych z kości wymarłych zwierząt, a następnie poddawanych PCR. Po wielu frustrujących porażkach opracowałem wreszcie zestaw praktyk laboratoryjnych służących zminimalizowaniu ryzyka zanieczyszczenia. I tak, Matthias przeprowadzał izolację materiału genetycznego, a także wszystkie inne czynności przygotowawcze do PCR w niewielkim pomieszczeniu odizolowanym od reszty laboratorium i pedantycznie utrzymywanym w czystości. Kiedy z matrycowego, starożytnego DNA, starterów i innych składników powstała już mieszanina reakcyjna, probówka była szczelnie zamykana i dopiero wtedy trafiała do „brudnej” części laboratorium. W „czystym” pokoju wszystkie powierzchnie raz na tydzień przemywaliśmy wybielaczem3, a każdej nocy naświetlaliśmy lampą UV, by zniszczyć ewentualne DNA fruwające w powietrzu wraz z kurzem. Do „czystego” pokoju można się było dostać jedynie przez przedsionek, w którym Matthias i inni laboranci przywdziewali strój roboczy: fartuchy, maski ochronne na twarz, siatki

na włosy i sterylne rękawice. Wszystkie potrzebne chemiczne reagenty i nowe wyposażenie wędrowały bezpośrednio do tego laboratorium i nic z innych części instytutu nie miało tam prawa trafić. Matthias, a także jego koledzy i koleżanki zaczynali swoją pracę właśnie w tym pomieszczeniu. Jeśli opuścili „czysty” pokój i znaleźli się w głównym laboratorium, gdzie są prowadzone badania nad różnym DNA, do końca dnia nie mieli już wstępu do „świątyni”. Ujmując to dość delikatnie, miałem lekką, ale ze wszech miar uzasadnioną obsesję na tym punkcie. Mimo wszystkich wymienionych środków ostrożności, zanieczyszczenia współczesnym DNA i tak się zdarzały, czego dowody zyskaliśmy zaraz po rozpoczęciu przez Matthiasa doświadczeń. Po namnożeniu za pomocą PCR fragmentu na matrycy mtDNA z kości sklonował otrzymane kopie (teoretycznie takie same) poprzez wprowadzenie ich do bakterii. Zrobił to przede wszystkim po to, by sprawdzić, czy wśród namnożonych odcinków DNA wszystkie powstały na tej samej matrycy, czy może matryc było więcej. Pojedyncza bakteria przyjmowała tylko jedną cząsteczkę DNA liczącą 61 nukleotydów, wstawioną w plazmid (kolista cząsteczka pozachromosomowego DNA występująca w cytoplazmie komórki, zdolna do autonomicznej replikacji), a następnie – po kilkunastu podziałach – dawała początek widocznej już gołym okiem kolonii, w której wszystkie bakterie zawierały przyjęty na początku plazmid. Sekwencjonując poszczególne klony bakteryjne, mogliśmy się przekonać, czy pojedyncze fragmenty DNA przyjęte przez bakterie wraz z plazmidem rzeczywiście są identyczne. W najwcześniejszym doświadczeniu Matthiasa 17 klonów miało taką samą wstawkę DNA w plazmidzie (tę różniącą się od ponad 2 tys. znanych sekwencji współczesnego ludzkiego mtDNA), ale jeden zawierał współczesną. Prawdopodobnie doszło kiedyś do zanieczyszczenia samej kości, która przez 140 lat od jej wykopania przeszła przez wiele rąk. Matthias powtórzył PCR i wprowadził wstawki do plazmidu bakteryjnego. Tym razem uzyskał 10 klonów bakteryjnych z unikatową sekwencją i dwa ze współczesnym DNA. Gdy wyizolował DNA z kolejnego kawałka kości, a potem ponownie przeprowadził PCR oraz klonowanie, otrzymał 10 klonów z potencjalną sekwencją neandertalczyka i cztery z sekwencją mtDNA człowieka współczesnego. Dopiero wtedy uznaliśmy, że nasz oryginalny wynik zdał pierwszy test na wiarygodność. Na kolejnym etapie Matthias rozpoczął wydłużanie odczytanej sekwencji. Wybrał startery umożliwiające namnożenie w PCR fragmentu mtDNA częściowo nachodzącego na pierwotny odcinek 61 nukleotydów (ilustracja 1.2). Okazało się, że także nowo odczytany ciąg różni się w niektórych pozycjach od wszystkich znanych sekwencji ludzi współczesnych. Przez kilka następnych miesięcy Matthias namnożył 13 nowych fragmentów DNA różnej długości, każdy przynajmniej dwukrotnie. Ich prawidłowy odczyt utrudniał fakt, że w DNA mogą się znaleźć przypadkowe mutacje powstałe na przykład wskutek kontaktu z niektórymi związkami chemicznymi, błędów w samym

sekwencjonowaniu, a nawet – co wprawdzie zdarza się bardzo rzadko – występowania w obrębie tej samej komórki więcej niż jednej wersji mtDNA. Między innymi z tego powodu przyjęliśmy taktykę postępowania, którą już wcześniej przetestowałem, badając zwierzęce DNA (ilustracja 1.2). Zaczęliśmy od stworzenia sekwencji konsensusowej (składającej się z nukleotydów statystycznie najczęściej pojawiających się w danym miejscu). Dla każdego odczytanego nukleotydu (A, T, G lub C) za konsensusowy uznawaliśmy ten, który powtarzał się w konkretnej pozycji podczas kilku odczytów. Jego identyfikację staraliśmy się potwierdzić przynajmniej w dwóch niezależnych eksperymentach, ponieważ w skrajnym przypadku matrycą dla PCR mogła być jedna nić helisy, co by znaczyło, że wskutek przypadkowego błędu w pierwszym cyklu wszystkie klony bakteryjne niosłyby plazmid ze wstawką z tym samym błędem. Jeśli dwie próby PCR mające potwierdzić dany wynik wykazywały różnicę gdziekolwiek w odczytywanym fragmencie, przeprowadzaliśmy trzecią, by rozstrzygnąć, który z wyników jest powtarzalny. Matthias wykorzystał łącznie 123 sklonowane fragmenty DNA i złożył ostatecznie odcinek najbardziej zmiennego ewolucyjnie fragmentu ​mtDNA liczący 379 nukleotydów. Jeśli się nie myliliśmy, a przyjęte przez nas kryteria były właściwe, mieliśmy do czynienia z sekwencją neandertalskiego mtDNA. Teraz mogliśmy już przystąpić do najprzyjemniejszej i najbardziej fascynującej części naszej pracy – porównań starożytnego DNA ze współczesnym. Ilustracja 1.2. Odtworzony fragment sekwencji mtDNA neandertalczyka z Doliny Neandra (osobnika typowego). Pierwsza od góry, dla porównania, sekwencja referencyjna człowieka współczesnego. W miejscach, gdzie porównywane sekwencje są identyczne, widnieje kropka, tam zaś, gdzie się różnią, jest pokazany nukleotyd odmienny od tego z sekwencji referencyjnej. Na samym dole odtworzony kompletny fragment sekwencji mtDNA neandertalczyka. Każda różnica w porównaniu z sekwencją referencyjną występowała w większości klonów bakteryjnych uzyskanych po przynajmniej dwóch niezależnych reakcjach PCR (na ilustracji nie pokazano wszystkich

wyników sekwencjonowania). Na podstawie: Matthias Krings i in., Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans, „Cell” 1997, nr 21, s. 19–30. Zaczęliśmy od zestawienia sekwencji neandertalczyka z odpowiadającymi jej odcinkami mtDNA pochodzącymi od 2051 współczesnych ludzi z różnych stron świata. Zaobserwowaliśmy średnio 28 jedno​nukleotydowych różnic między neandertalczykiem a człowiekiem współczesnym, podczas gdy między dwojgiem współczesnych ludzi w tym samym odcinku występuje średnio siedem zmian. Zatem neandertalskie mtDNA różniło się od naszego cztery razy bardziej. Następnie sprawdziliśmy, czy nie wykazuje ono przypadkiem szczególnego podobieństwa do jego odpowiednika u współczesnych Europejczyków. Zakładaliśmy, że to możliwe, skoro Homo neanderthalensis wyewoluował i żył na terenach Europy i zachodniej Azji; zresztą wielu paleoantropologów przypuszczało, że neandertalczycy mogli być przodkami mieszkańców Europy. Porównaliśmy zatem sekwencję starożytnego mtDNA z sekwencjami 510 współczesnych Europejczyków. Różniły się średnio o 28 nukleotydów. Następnie Europejczyków zastąpiliśmy 478 Afrykanami i Azjatami. Wynik był identyczny. To oznaczało, że współcześni mieszkańcy tych trzech kontynentów różnią się od neandertalczyków w równym stopniu. Może jednak uśredniony wynik nie był odpowiednim kryterium? Może neandertalskie mtDNA było bardziej podobne do współczesnego tylko u niektórych grup Europejczyków, a nie u wszystkich? Wydawało się to całkiem rozsądnym założeniem, więc je sprawdziliśmy. Okazało się, że najbardziej podobne współczesne sekwencje mtDNA z Europy różnią się od neandertalskiej o 23 nukleotydy. W przypadku Afrykanów i Azjatów różnica wynosiła – odpowiednio – 23 i 22 nukleotydy. Krótko mówiąc, nasze wyniki świadczyły o tym, że badane mtDNA jest nie tylko odmienne od mtDNA ogółu ludzi współczesnych, lecz także nie wykazuje większego podobieństwa do mtDNA którejkolwiek z grup dzisiejszych Europejczyków. Oczywiście nie zapominaliśmy, że samo mechaniczne zliczenie różnic to za mało, by dokonać próby wiarygodnego naszkicowania ewolucyjnej historii danego fragmentu DNA. Zmiany w jego sekwencji powstają wskutek utrwalonych mutacji, niektóre jednak występują z większą częstotliwością, a poza tym DNA w pewnych pozycjach przekształca się częściej. W tych właśnie miejscach w przeszłości mogła zajść więcej niż jedna zmiana, zatem żeby możliwie wiarygodnie określić historię fragmentu mtDNA, musieliśmy użyć modeli statystycznych uwzględniających między innymi fakt, że na danej pozycji mutacje mogły zachodzić wielokrotnie i – dajmy na to – przywrócić wyjściowy nukleotyd. Po dokonaniu tego typu analizy i rekonstrukcji można ostatecznie narysować drzewo filogenetyczne. Na końcach jego gałęzi znajdują się porównywane sekwencje, a każdy punkt rozgałęzienia reprezentuje sekwencję wspólną dla każdej odnogi (ilustracja 1.3). Kiedy sporządziliśmy takie drzewo, dostrzegliśmy bez trudu, że

wszystkie wersje mtDNA ludzi współczesnych wywodzą się od mtDNA wspólnego przodka. Ilustracja 1.3. Drzewo filogenetyczne sporządzone na podstawie różnic nukleotydowych w sekwencji mtDNA, pokazujące, w jaki sposób mtDNA występujące we współczesnej ludzkiej populacji wyewoluowało od sekwencji występującej u wspólnego przodka (mitochondrialnej Ewy; na ilustracji jej sekwencję oznaczono szarą kropką). Liczby obok poszczególnych gałęzi odnoszą się do statystycznego prawdopodobieństwa przedstawionego układu węzłów i gałęzi drzewa. Na podstawie: Matthias Krings i in., Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans, „Cell” 1997, nr 21, s. 19–30; rys. zmodyfikowany. Nie było to szczególnym zaskoczeniem, albowiem wiadomo o tym już od lat 80., z prac Allana Wilsona4. W naszych komórkach występuje tylko jeden typ mtDNA. Jego cząsteczki nie rekombinują z ich odpowiednikami u innych ludzi, gdyż jest ono przekazywane tylko w linii żeńskiej. Gdy kobieta nie ma córek, jej linia mtDNA wymiera. W przeszłości istniała zatem kobieta – mitochondrialna Ewa – której mtDNA dało początek wszystkim dziś istniejącym jego wersjom.

Z naszych modeli do analizy sekwencji i z przyjętych założeń wynikało, że neandertalskie mtDNA nie wywodzi się od mitochondrialnej Ewy. Wyglądało raczej na to, że ona i neandertalczyk mieli wcześniej wspólnego przodka, a potem ich linie się rozdzieliły. To było naprawdę niezwykłe. Uzyskaliśmy dowód, że wyizolowaliśmy i odczytaliśmy fragment DNA należący do neandertalczyka, który znacznie się od nas różnił (przynajmniej jeśli chodzi o tę część kwasu deoksyrybonukleinowego). Spróbowaliśmy określić w przybliżeniu, kiedy żył wspólny przodek neandertalczyków i ludzi. Na podstawie liczby różnic między dwoma sekwencjami mtDNA można określić, jak długo były one przekazywane z pokolenia na pokolenie w oddzielnych liniach ewolucyjnych. Częstość pojawiania się mutacji u dalekich od siebie gatunków, dajmy na to myszy i małp, może się znacząco różnić, lecz u tych bliżej spokrewnionych, na przykład u ludzi współczesnych, neandertalczyków i małp człekokształtnych, jest podobna. Po uwzględnieniu tych danych naukowcy potrafią oszacować w przybliżeniu, jak dawno temu istniała sekwencja wyjściowa (wspólna) dla dwóch potomnych linii ewolucyjnych. Wykorzystując model uwzględniający szybkość, z jaką różne rodzaje mutacji zachodzą w mtDNA, wyliczyliśmy, że protoplastka ludzkiego mtDNA, mitochondrialna Ewa, żyła 100–200 tys. lat temu, co zgadzało się z wnioskami Allana Wilsona, a wspólna mitochondrialna przodkini ludzi i neandertalczyków – około 500 tys. lat temu. Wyniki naszych badań były fascynujące. Teraz nie miałem już wątpliwości, że udało nam się odczytać DNA neandertalczyka i że różniło się ono od DNA ludzi współczesnych. Do opublikowania wyników brakowało nam jeszcze tylko ich potwierdzenia z innego laboratorium. W niezależnym doświadczeniu nie trzeba było odtwarzać całego fragmentu o długości 379 nukleotydów; wystarczyłoby wyizolować i odczytać odcinek mtDNA zawierający unikatowe dla neandertalczyka zmiany w sekwencji. Byłby to dowód, że odczytany przez nas zapis naprawdę pochodzi z resztek DNA neandertalczyka, a nie jest przypadkowym zanieczyszczeniem, w jakiś niezwykły sposób trapiącym nasze laboratorium. Tylko do kogo powinniśmy się zwrócić? Wybór należało dobrze przemyśleć. Z pewnością wiele grup badawczych chętnie nawiązałoby współpracę przy tak spektakularnym i potencjalnie bardzo opłacalnym naukowo projekcie. Problem w tym, że jeśli nasi przyszli współpracownicy nie podzielaliby naszej obsesji na punkcie minimalizacji ryzyka zanieczyszczeń i nie mieli dużego doświadczenia w dość specyficznych badaniach nad starożytnym DNA, mogliby nie dać sobie rady z powierzonym zadaniem. Gdyby im się nie udało, nasze wyniki nie spełniałyby kryterium powtarzalności i nie nadawałyby się do publikacji. Zdawałem sobie sprawę, że nie ma drugiej grupy badawczej, która zajmowałaby się badaniem starożytnego DNA od tak dawna, jak my, ale w końcu wybraliśmy – postanowiliśmy zwrócić się do Marka Stonekinga, genetyka populacyjnego z Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii.

Mark był doktorantem, a potem postdokiem5 w laboratorium Allana Wilsona na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley. Miałem okazję poznać go podczas mojego pobytu na stażu podoktorskim w tym właśnie miejscu pod koniec 1980 roku. Należał do grona osób, które stworzyły koncepcję mitochondrialnej Ewy, i był jednym z głównych autorów słynnej teorii wyjścia z Afryki, wyjaśniającej pochodzenie człowieka współczesnego. Zgodnie z nią ludzie współcześni pojawili się w Afryce 100–200 tys. lat temu, a następnie skolonizowali resztę świata, wypierając inne gatunki wczesnych ludzi (między innymi neandertalczyków z Europy), nie krzyżując się z nimi. Ceniłem Marka za trzeźwy umysł i uczciwość, a poza tym wiedziałem, że dobrze się z nim współpracuje. Co więcej, jedna z jego doktorantek, Anne Stone, okres od 1992 do 1993 roku spędziła w naszym laboratorium. Była rozsądna, pracowita i ambitna, a ponieważ zajmowała się u nas izolacją mtDNA z pozostałości szkieletów Indian, dobrze znała nasze techniki i procedury. Wiedziałem, że jeśli ktoś może udanie powtórzyć doświadczenie Matthiasa, to tylko ona. Skontaktowałem się z Markiem. Jak można się było spodziewać, wraz z Anne natychmiast zapalili się do pomysłu powtórzenia naszego eksperymentu. Przesłaliśmy im zatem ostatnie fragmenty kości otrzymane wcześniej od Ralfa i wskazaliśmy, który odcinek mtDNA powinni starać się namnożyć, by zwiększyć szansę, że uda im się odczytać sekwencję z nukleotydami charakterystycznymi dla neandertalczyka. Startery do PCR i wszystkie niezbędne reagenty mieli już przygotować sobie sami. Fragment kości trafił do nich w oryginalnym, szczelnym opakowaniu, tym samym, w którym otrzymaliśmy go z Bonn. Wszystkie te środki ostrożności były dodatkowym zabezpieczeniem przed przeniesieniem potencjalnego zanieczyszczenia do ich laboratorium. Na wszelki wypadek – by nic im nie sugerować – nie powiedzieliśmy, jakie zmiany zidentyfikowaliśmy jako unikatowe dla neandertalczyka. Krótko mówiąc, Anne miała za zadanie sama zaprojektować niezbędne startery i wykonać wszystkie konieczne czynności, nie wiedząc, jakiego wyniku powinna oczekiwać. Po wysłaniu przesyłki z kością pocztą kurierską mogliśmy już tylko czekać. Generalnie rzecz biorąc, tego typu eksperymenty zawsze zabierają więcej czasu, niż się planuje; a to firmie syntetyzującej zdarzy się opóźnienie, a to test kontrolny wykryje zanieczyszczenie w jednym z reagentów, a to w dniu zaplanowanym na uruchomienie sekwenatora zachoruje obsługujący go technik… Całą wieczność czekaliśmy na telefon od Anne. W końcu się doczekaliśmy, ale już po tonie jej głosu poznałem, że nie jest zadowolona. Sklonowała 15 wstawek z PCR, namnożonych na matrycy mtDNA wyizolowanego z kości, i wszystkie przypominały współczesne DNA. Ogarnęła mnie czarna rozpacz. Co się stało? Czy namnożyliśmy jakieś dziwaczne DNA? Nie chciało mi się w to wierzyć. Gdybyśmy na przykład mieli do czynienia z mtDNA zwierzęcia, nie byłoby przecież tak podobne do ludzkiego. Nie mogło to być też DNA jakiegoś zupełnie nietypowego pod względem genetycznym człowieka; bez przesady, nawet ktoś

bardzo wyjątkowy nie miałby DNA cztery razy bardziej odmiennego niż reszta światowej populacji. Była jeszcze i taka możliwość, że odczytana przez nas sekwencja powstała wskutek nieznanych nam chemicznych modyfikacji dawnego DNA, niemniej jednak w takiej sytuacji powinna przypominać ludzką z nietypowymi zmianami, a nie pochodzącą od przedstawiciela linii, która już dawno, dawno temu wyraźnie się oddzieliła od naszej – na co wskazywały analizy, na podstawie których narysowaliśmy drzewo filogenetyczne. No i w dodatku Anne też powinna ją odczytać… Jedyne sensowne wytłumaczenie było takie, że jej próbki okazały się bardziej zanieczyszczone od naszych i fragmenty obcego DNA były w nich znacznie liczniejsze niż odcinki mtDNA neandertalczyka. Co mogliśmy jeszcze zrobić? Poproszenie Ralfa o następny kawałek kości wydawało się ostatecznością; w końcu naprawdę nie wiedzieliśmy, czy kolejny eksperyment Anne zakończyłby się powodzeniem. A może, gdyby zanieczyszczenia współczesnym ludzkim mtDNA w próbkach Anne nie były wielkie, po zsekwencjonowaniu kilku tysięcy klonów wreszcie udałoby się jej natrafić na sekwencję neandertalską? Przeprowadziliśmy eksperyment, by choć w przybliżeniu określić liczbę cząsteczek neandertalskiego mtDNA w naszym ekstrakcie z kości, który wykorzystywaliśmy do PCR. Okazało się, że było w nim raptem około 50 molekuł pradawnego mtDNA, a więc bardzo, bardzo mało – cząstka kurzu fruwającego w powietrzu mogła zawierać dziesiątki czy nawet setki tysięcy cząsteczek mtDNA. Próby odnalezienia właściwego klonu po PCR na matrycy zanieczyszczonej do tego stopnia nie miałyby więc szans powodzenia. Długo dyskutowaliśmy na spotkaniach całej grupy, co robić dalej. W ciągu swojej pracy zawodowej nauczyłem się, że burza mózgów jest bardzo przydatna, a często wręcz kluczowa dla osiągania dobrych wyników. Wymiana poglądów pozwala narodzić się pomysłom, które inaczej nigdy nie przyszłyby do głowy badaczom skupionym tylko na swoich doświadczeniach. Mało tego, trzeźwe spojrzenie osób niezaangażowanych bezpośrednio w projekt pozwala uniknąć myślenia życzeniowego, jakże często pojawiającego się u naukowców pracujących nad zagadnieniami, od których zależy rozwój ich kariery. Moja rola podczas tych spotkań ograniczała się zazwyczaj do moderowania dyskusji i wybierania spośród przedstawianych pomysłów tych najbardziej obiecujących. Burza mózgów udała się i tym razem. W końcu wymyśliliśmy, co należy zrobić. Postanowiliśmy poprosić Anne o takie zmodyfikowanie starterów, by nukleotydy na końcu ich sekwencji pasowały do tych neandertalczyka. Zmienione w ten sposób powinny faworyzować matrycę neandertalskiego mtDNA. Długo zastanawialiśmy się, czy taka modyfikacja jest zgodna z wymogiem niezależnego powtórzenia pracy Matthiasa przez inne laboratorium. Oczywiście najlepiej by było, gdyby Anne uzyskała wyniki podobne do naszych zupełnie samodzielnie, nie korzystając z informacji dotyczącej odczytanego przez nas mtDNA. Mogliśmy jej jednak zasugerować, by

zastosowała startery namnażające fragment, w którym powinny być obecne dwa inne unikatowe dla neandertalczyka nukleotydy, o czym nie musieliśmy już jej mówić. Gdyby przeprowadzone przez nią sekwencjonowanie potwierdziło obecność nietypowych nukleotydów w namnożonym odcinku, mielibyśmy dowód, że powielone DNA powstało na matrycy unikatowego DNA wyizolowanego z kości. Zgodziliśmy się w końcu, że takie działanie nie narusza zasady niezależnego powtórzenia. Przekazaliśmy konieczne informacje Anne, a ona zamówiła nowe startery. Znowu mogliśmy tylko czekać. Tymczasem była już połowa grudnia. Anne uprzedzała, że na święta wybiera się do rodziny w Karolinie Północnej. Niestety, nie mogłem jej zasugerować, by zrezygnowała z wyjazdu, choć miałem taką pokusę. Wreszcie po prawie dwóch tygodniach telefon zadzwonił. Zsekwencjonowała pięć wstawek uzyskanych po nowym PCR. Wszystkie zawierały nukleotydy unikatowe, charakterystyczne dla neandertalskiego mtDNA. Poczuliśmy olbrzymią ulgę. Uznałem, że zasługujemy na porządne świąteczne ferie. Z dobrą nowiną zadzwoniliśmy też do Ralfa, do Bonn. Tak jak wiele razy wcześniej podczas mojego pobytu w Monachium, świętowałem Nowy Rok na stoku, szusując wraz ze znajomymi naukowcami w mniej dostępnych partiach Alp, blisko austriackiej granicy. Tym razem jednak, zamiast podziwiać przepiękne doliny, łapałem się co chwila na układaniu w myślach pracy, w której opiszemy nasze wyniki i podamy do publicznej wiadomości sekwencję pierwszego fragmentu DNA neandertalczyka. Góry i śnieżne pejzaże w zestawieniu z tym osiągnięciem po prostu przegrywały. Po feriach razem z Matthiasem zaczęliśmy pisać artykuł. Zastanawialiśmy się, do którego czasopisma powinniśmy go zgłosić. Brytyjskie „Nature” i amerykańskie „Science” cieszą się największym prestiżem w świecie naukowym i w mediach, a zatem najlepszy wydawał się wybór któregoś z nich, jednak oba te tygodniki narzucają ścisłe ograniczenia co do długości zgłaszanych tekstów, a ja chciałem dokładnie opisać metodykę naszej pracy, między innymi w celu rozpropagowania stosowanych przez nas pedantycznych procedur i technik związanych z izolacją i badaniem starożytnego DNA. Poza tym miałem za złe redakcjom obu tych pism, że przyjmują i publikują kiepsko udokumentowane prace dotyczące starożytnego DNA – opisywane w nich wyniki, tak w opinii mojej, jak i moich współpracowników, często budziły poważne wątpliwości. Miałem wrażenie, że redaktorzy przymykają czasem oko na spójność, wiarygodność i sposób uzyskania przedstawianych w pracach rezultatów, jeśli tylko są one na tyle sensacyjne, by mogły zapewnić wzmiankę na łamach „New York Timesa”. Zwróciłem się ze swoimi wątpliwościami do Tomasa Lindahla, pochodzącego ze Szwecji genetyka pracującego w londyńskim Centrum Badań Raka. Tomas, uznany

ekspert w dziedzinie uszkodzeń DNA, jest małomówny i opanowany, ale nie należy tego mylić z nieśmiałością czy brakiem pewności siebie. Poznałem go w 1985 roku i sześć lat spędziłem w jego laboratorium, badając chemiczne uszkodzenia starożytnego DNA. Był moim mentorem. Teraz, wysłuchawszy mnie, zasugerował, bym zamiast do „Nature” czy „Science”, zgłosił pracę do „Cell”, także cenionego czasopisma naukowego, specjalizującego się w biologii komórkowej i molekularnej. Wybierając ten dwutygodnik, wysłałbym sygnał, że nasza praca opiera się na solidnych podstawach i nie służy jedynie budowaniu popularności, w przeciwieństwie do publikacji, które są może sexy, lecz brak im fundamentów. W dodatku „Cell” przyjmowało nawet długie prace. Tomas zadzwonił do jednego z tamtejszych redaktorów, Benjamina Lewina, by wysondować, czy pismo byłoby zainteresowane naszym artykułem, mimo że nieco wykraczał on tematycznie poza dziedziny, którymi zwykle zajmowano się na łamach tego periodyku. Lewin powiedział, że nie widzi problemu i że wyśle nasz tekst do recenzentów. To była znakomita wiadomość. Mogliśmy opisać swoje doświadczenia ze szczegółami i przedstawić wszystkie argumenty przemawiające za tezą, że naprawdę odczytaliśmy DNA neandertalczyka. Do dziś uważam, że jest to jedna z najlepszych prac w moim dorobku. Prócz drobiazgowego opisania użytej przez nas metody rekonstrukcji mtDNA, przedstawiliśmy dowody, że jego sekwencja wyraźnie odróżnia się od mtDNA współczesnego. Wnioski z badań zgadzały się z teorią wyjścia z Afryki, sformułowaną i wspieraną przez Allana Wilsona, Marka Stonekinga i innych. Napisaliśmy w tej pracy: „Sekwencja neandertalskiego mtDNA potwierdza scenariusz, zgodnie z którym ludzie współcześni pojawili się niedawno w Afryce jako osobny gatunek, a następnie zastąpili neandertalczyków, ale nie krzyżowali się z nimi lub krzyżowali w ograniczonym stopniu”. Staraliśmy się rozbroić wszelkie możliwe miny w interpretacji przedstawionych wyników; podkreślaliśmy na przykład, że na podstawie mtDNA można jedynie w ograniczonym stopniu wnioskować na temat genetycznej historii gatunków, ponieważ jest ono przekazywane tylko w linii żeńskiej. Gdyby neandertalczycy krzyżowali się z ludźmi współczesnymi, moglibyśmy wykryć ślad takich związków tylko w przypadku, kiedy to kobiety zmieniały grupy, w których żyły, a tak wcale nie musiało być. Wiadomo, że w czasach nam bliższych, gdy stykały się ze sobą ludzkie grupy stojące na różnych szczeblach społecznego rozwoju, często dochodziło między nimi do kontaktów seksualnych oraz pojawienia się mieszanego potomstwa, ale zwykle odbywało się to według tego samego schematu: mężczyzna pochodził z grupy o wyższym statusie, a kobieta z tej o niższym; rzadziej odwrotnie, potomstwo zaś na ogół pozostawało z matką. Nie wiemy, czy ta sama zależność istniała już 35 tys. lat temu, gdy ludzie współcześni przybyli do Europy i spotkali tam neandertalczyków. Nie wiemy też wcale, czy to ludzie współcześni byli grupą o wyższym statusie socjalnym,

a nawet czy porównania stosunków socjalnych między grupami ludzi nam podobnych można odnosić do relacji między ludźmi współczesnymi i neandertalczykami. Tak więc z pewnością żeńska część tej historii nie mówi nam wszystkiego. Ważniejsze jednak wydawało nam się inne zastrzeżenie, jakie można było mieć do wniosków wysnuwanych na podstawie analiz mtDNA. Ma ono związek z jego dziedziczeniem. Jak już wspominałem, indywidualne mtDNA nie wymienia żadnych fragmentów z tego rodzaju cząsteczkami u innych osób. Co więcej, gdy kobieta ma samych synów, jej linia mtDNA wymiera. Ważną rolę odgrywa tu przypadek, tak więc nawet gdyby 35–30 tys. lat temu cząsteczki neandertalskiego mtDNA trafiły do populacji ludzi współczesnych, to do dziś mogły z niej po prostu zniknąć. Byłoby więc zupełnie inaczej niż z DNA chromosomalnym w jądrze komórkowym; przypomnijmy, że jest ono zebrane w pary chromosomów, z których jeden zawsze pochodzi od ojca, a drugi od matki. Podczas powstawania plemników i komórek jajowych chromosomy pękają i w niezwykłym tańcu wymieniają się fragmentami. Gdybyśmy mogli przyjrzeć się różnym regionom jądrowego genomu danej osoby, uzyskalibyśmy kilka odmiennych wersji genetycznej historii jego posiadacza i jego krewnych. Nawet gdyby wszystkie ślady po domieszce neandertalskich genów zniknęły w jednym miejscu, dałoby się je dostrzec gdzie indziej. W ten sposób, odczytując różne fragmenty genomu jądrowego, uzyskalibyśmy obraz znacznie mniej zniekształcony przez przypadkowe zdarzenia. To dlatego w swojej pracy napisaliśmy, że nasze ustalenia „nie wykluczają możliwości, by neandertalczycy mogli przekazywać inne niż mitochondrialne geny ludziom współczesnym”. Niemniej jednak, w świetle otrzymanych wyników, jasno opowiadaliśmy się za teorią wyjścia z Afryki. Recenzje były pozytywne, a naszą publikację „Cell” przyjęło do druku tylko z drobnymi poprawkami. Redaktorzy nalegali jedynie, by nie ogłaszać wyników przed ukazaniem się numeru z 11 lipca (tom 2)6. Przygotowali materiały dla dziennikarzy i w dniu publikacji zorganizowali konferencję prasową w Londynie. Po raz pierwszy odczułem na własnej skórze, co to znaczy znaleźć się nagle w centrum zainteresowania mediów. Z pewnym zaskoczeniem odkryłem przy tym, że tłumaczenie, jakie wnioski płyną z naszych badań i na jakie haczyki interpretacyjne trzeba uważać, sprawia mi przyjemność. Jak się potem okazało, nasze wyniki miały bezpośrednie konsekwencje dla przebiegu trwającej już od ponad 10 lat zażartej bitwy między paleoantropologami. U jej początków leżało sformułowanie przez Allana Wilsona i współpracowników wspomnianej już teorii wyjścia z Afryki, w dużej mierze opierającej się na porównaniach mtDNA krążących we współczesnej ludzkiej populacji. Początkowo koncepcja ta spotkała się raczej z chłodnym – żeby nie powiedzieć wrogim – przyjęciem społeczności paleontologów. Niemal wszyscy opowiadali się wówczas za hipotezą multiregionalną, w myśl której człowiek współczesny ewoluował w wielu

miejscach świata, w grupach mniej lub bardziej od siebie odizolowanych i pochodzących od jednego, dawnego przodka, za którego był uznawany Homo erectus. Uważali, że poszczególne ludzkie grupy miały różnych protoplastów. I tak na przykład przodkami współczesnych Europejczyków mieli być neandertalczycy i być może jeszcze jakieś inne grupy homininów, Azjaci zaś mieli pochodzić od potomków człowieka pekińskiego. Z czasem jednak rosnąca grupa paleontologów, na czele z Chrisem Stringerem z Muzeum Historii Naturalnej w Londynie, uznała teorię wyjścia z Afryki za najbardziej zgodną z wnioskami płynącymi z badań skamieniałości. Redaktorzy „Cell” zaprosili zresztą Chrisa na naszą konferencję prasową, gdzie był łaskaw stwierdzić, że odczytanie neandertalskiego DNA jest dla paleontologii tym, czym lądowanie na Księżycu dla eksploracji kosmosu. Nie powiem, by nie sprawiło mi to przyjemności (choć skłamałbym też, gdybym utrzymywał, że nie spodziewałem się komplementów). Jeszcze większą satysfakcję przyniosły mi pochwały ze strony przedstawicieli drugiej strony sporu, czyli multiregionalistów, którzy docenili techniczną część naszej pracy, a zwłaszcza gdy najbardziej głośny i zadziorny z nich, Milford Wolpoff z Uniwersytetu Stanowego Michigan, napisał w komentarzu na łamach „Science”, że „jeśli ktokolwiek mógł tego dokonać, to tylko Svante”. Zainteresowanie publikacją znacznie przerosło moje oczekiwania. Nasze wyniki trafiły na czołówki wielu poważnych gazet, mówiono o nich w radio i telewizji na całym świecie. Tydzień po ukazaniu się pracy spędziłem głównie na odbieraniu telefonów od dziennikarzy. Pracowałem nad starożytnym DNA od 1984 roku i dość dawno uświadomiłem sobie, że wyizolowanie DNA ze szczątków neandertalczyka było możliwe, przynajmniej teoretycznie. Poza tym minęło już dziewięć miesięcy od telefonu Matthiasa, który obudził mnie, by powiedzieć, że analizowana przez niego sekwencja nie pochodzi od człowieka współczesnego, tak więc miałem trochę czasu na oswojenie się z naszym dokonaniem i – w przeciwieństwie do wielu ludzi na całym świecie – przestało mnie ono przyprawiać o dreszcze. Kiedy całe to zaskakujące szaleństwo z mediami trochę się uspokoiło, poczułem, że muszę odetchnąć, przemyśleć spokojnie, co już osiągnąłem – i co chciałbym robić w przyszłości. 1 Ang. polymerase chain reaction. Ten i inne przypisy oznaczone gwiazdką pochodzą od tłumacza. 2 Ang. ancient DNA, aDNA, nazywane jest także antycznym lub kopalnym DNA. 3 Standardowy środek odkażający stosowany w laboratoriach, skuteczny i tani. 4 Rebecca L. Cann, Mark Stoneking i Allan C. Wilson, Mitochondrial DNA and human evolution, „Nature” 1987, nr 325, s. 31–36.